RNA提取與檢測技術全流程解析

一、技術原理與核心挑戰

核糖核酸（RNA）是基因表達的關鍵載體，其提取與檢測是分子生物學研究的基石。該過程面臨核心挑戰：無處不在的RNA酶（RNase）。這類酶活性極強，能迅速降解RNA分子。此外，RNA自身的不穩定性也對操作的時效性和環境控制提出高要求。

二、標準操作流程詳解

• 樣本前處理：

  • 組織樣本： 快速取材后投入液氮速凍或專用保存液，避免RNA降解。研磨需在液氮或低溫環境下進行，確保充分勻漿。
  • 細胞樣本： 胰酶消化后立即裂解或離心收集細胞沉淀，快速進入裂解步驟。
  • 血液樣本： 通常使用含抗凝劑的采血管，需盡快分離目標細胞（如白細胞）或血漿/血清，并加入裂解液。

• 細胞裂解：

  • 使用強變性裂解液（常含異硫氰酸胍、苯酚、SDS等成分），高效破壞細胞結構，釋放核酸并使RNase失活。
  • 關鍵點： 裂解需快速、徹底，確保樣本與裂解液充分混勻。

• 核酸分離：

  • 有機溶劑萃取法（如Trizol法）： 加入氯仿等有機溶劑離心分層，RNA選擇性進入上層水相，DNA和蛋白質位于中間層及下層有機相。
  • 硅膠膜吸附法（離心柱法）： 裂解液經特定條件（如高鹽、乙醇存在）處理后，RNA特異地結合到硅膠膜上，后續通過洗滌去除雜質。此法操作簡便，應用廣泛。
  • 磁珠法： 表面修飾的磁珠在特定緩沖條件下特異吸附RNA，利用磁場實現分離和洗滌，適合自動化高通量提取。

• RNA純化：

  • 徹底去除殘留的蛋白質、基因組DNA（gDNA）、鹽離子、有機溶劑等雜質。
  • DNase處理： 通常在純化過程中或純化后加入無RNase的DNase酶，消化殘留的gDNA，這對后續RT-qPCR等應用至關重要。
  • 洗滌： 使用不同濃度的乙醇緩沖液清洗吸附材料（硅膠膜或磁珠），去除雜質。
  • 干燥（離心柱法）： 離心去除殘留乙醇。
  • 洗脫： 使用無RNase水或低鹽緩沖液將純化的RNA從吸附材料上洗脫下來。

• 濃度與純度測定：

  • 紫外分光光度法：
    • 原理： 利用核酸在260nm波長處有特征吸收峰。
    • 操作： 取少量RNA溶液，使用微量紫外分光光度計測量OD260值。
    • 計算濃度： RNA濃度 (ng/µL) ≈ OD260值 × 40 × 稀釋倍數。
    • 評估純度：
      • OD260/OD280比值： 反映蛋白質污染程度。純凈RNA比值約為1.8-2.1。低于1.8提示蛋白質殘留；高于2.1可能提示殘留異硫氰酸胍或苯酚。
      • OD260/OD230比值： 反映小分子雜質（如鹽離子、胍鹽、EDTA、酚、乙醇等）污染程度。純凈RNA比值應大于2.0。低比值提示需進一步純化。

• 完整性評估：

  • 瓊脂糖凝膠電泳：
    • 原理： 基于分子量大小分離核酸。
    • 操作： 取適量RNA與上樣緩沖液混合，點樣于含核酸染料的瓊脂糖凝膠（通常1-2%）上，進行電泳。
    • 結果判讀：
      • 真核生物總RNA： 應清晰可見28S rRNA和18S rRNA兩條主帶，28S條帶亮度約為18S的1.5-2倍。條帶應銳利，無拖尾現象。5S rRNA及tRNA條帶通常較弱。
      • 完整性指標： 28S/18S比值接近2:1是完整RNA的標志。出現smear（涂抹）或主帶缺失/變弱提示降解。
    • 優點： 直觀，成本低。
    • 缺點： 靈敏度有限，需樣本量相對較多，EB染料有毒性（可選用安全染料）。
  • 微流控芯片電泳（如Bioanalyzer, TapeStation）：
    • 原理： 自動化微流控芯片技術結合熒光檢測。
    • 操作： 將少量RNA樣本與染料、標記物、上樣緩沖液混合，注入芯片孔道，儀器自動完成電泳、檢測和數據分析。
    • 結果輸出：
      • 電泳圖： 顯示rRNA峰圖（真核樣本）。
      • RNA完整值： 根據峰圖計算出的數值化指標（如RIN, RQI, DIN等），范圍通常1-10，數值越高代表完整性越好（如RIN > 7通常認為質量良好）。
      • 濃度估算。
    • 優點： 靈敏度高，樣本用量少（ng級），自動化，提供客觀的RIN值，通量較高。
    • 缺點： 儀器和耗材成本高。

三、常見問題與解決方案

• 低得率：
  • 樣本起始量不足。
  • 裂解不充分（組織未磨碎，細胞未完全裂解）。
  • 結合/吸附效率低（離心柱或磁珠問題，裂解液/結合液比例不當）。
  • 洗滌過程中RNA丟失（過度洗滌）。
  • 洗脫不充分（洗脫液體積過小、次數少或未充分接觸）。
• 純度差（OD260/280低）：
  • 蛋白質污染（裂解不徹底，洗滌不充分）。
  • 樣本本身富含蛋白/多糖/脂質（如植物、脂肪組織、血液）。
  • 分光光度計測量誤差（溶液pH值影響極大，低濃度樣本誤差大）。
• 純度差（OD260/230低）：
  • 鹽離子殘留（洗滌不充分，未按要求使用乙醇）。
  • 胍鹽、酚、乙醇等有機溶劑殘留（洗滌不充分，干燥不徹底）。
  • 碳水化合物或胍鹽污染。
• RNA降解：
  • 樣本離體后未及時處理或保存不當。
  • 操作過程中RNase污染（環境、器皿、試劑、手）。
  • 裂解液效力不足或失效。
  • 操作溫度過高（未在冰上操作）。
• gDNA殘留：
  • DNase消化效率低（酶失活、反應條件不當、含抑制物）。
  • DNase消化后未完全去除或滅活。

四、關鍵注意事項

1. 嚴防RNase污染：
   • 全程佩戴一次性手套并勤換。
   • 使用無RNase的專用耗材（離心管、槍頭等）。
   • 實驗臺面、移液器表面定期用專用RNase清除劑或稀釋的次氯酸鈉溶液擦拭。
   • 配制溶液使用無RNase的水（如經DEPC處理并高壓滅菌的超純水）。
   • 盡可能在低溫（冰上）操作。
2. 樣本新鮮度： 離體樣本應盡快處理或投入穩定化試劑/液氮中。
3. 試劑與耗材質量： 確保使用合格且未過期的試劑耗材。
4. 操作規范： 嚴格遵循所選方法的操作規程。
5. 儀器校準： 定期校準分光光度計、離心機等儀器。
6. 結果判讀： 結合濃度、純度比值和完整性評估（電泳或RIN值）綜合判斷RNA質量是否適合下游應用。

成功的RNA提取與檢測是獲得可靠分子生物學數據的前提。理解原理、優化流程、嚴格防控RNase污染、規范操作并準確解讀檢測結果，是獲得高質量RNA的關鍵。研究者應根據樣本類型、下游應用需求和實驗室條件，選擇最適合的提取與檢測方法。