酸性蛋白酶活力檢測：檢測項目詳解

引言

一、檢測原理

1. 原理：酸性蛋白酶在特定條件下水解酪蛋白，產(chǎn)生含有酚羥基的酪氨酸等產(chǎn)物。這些產(chǎn)物與Folin-酚試劑反應生成藍色復合物，在680 nm處測定吸光度，通過標準曲線計算酪氨酸釋放量，間接反映酶活力。

二、檢測項目詳述

（一）試劑與儀器

1. • 底物溶液：1%酪蛋白（溶于pH 3.0乳酸-乳酸鈉緩沖液）。
   • Folin-酚試劑：現(xiàn)用現(xiàn)配，含A液（碳酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉）和B液（硫酸銅、磷鉬酸）。
   • 終止劑：0.4 mol/L三氯乙酸（TCA）。
   • 標準溶液：0.1 mg/mL L-酪氨酸溶液（用于標準曲線）。
2. • 分光光度計、恒溫水浴鍋（37±0.1℃）、離心機、計時器、移液器、分析天平。

（二）樣品制備

1. 酶液稀釋：將待測酶液用pH 3.0緩沖液稀釋至適當濃度（確保反應在吸光度線性范圍內(nèi)）。
2. 空白對照：以滅活酶液（沸水浴處理5分鐘）作為空白。

（三）檢測步驟

1. • 取0-1.0 mL酪氨酸標準液，補緩沖液至1 mL，加入5 mL Folin-酚試劑，37℃顯色20分鐘。
   • 測定680 nm吸光度，繪制濃度-吸光度標準曲線。
2. • 加樣：取0.5 mL稀釋酶液 + 1 mL酪蛋白底物，37℃水浴精確反應10分鐘。
   • 終止：加入2 mL TCA終止反應，靜置10分鐘后離心（4000 rpm, 10分鐘）。
3. • 取上清液1 mL，加5 mL Folin-酚試劑，37℃顯色20分鐘。
   • 測定吸光度，空白調(diào)零。

（四）計算酶活力

1. • ?C：標準曲線查得酪氨酸量（μg）；
   • ?總V總?：反應體系總體積（mL）；
   • ?D：稀釋倍數(shù)；
   • ?T：反應時間（min）；
   • ?酶V酶?：酶液體積（mL）。
2.  

（五）注意事項

1. 反應條件控制：
   • pH和溫度需嚴格精確，偏差±0.1顯著影響結(jié)果。
   • 反應時間根據(jù)酶活力調(diào)整，確保吸光度在標準曲線線性范圍內(nèi)。
2. 操作要點：
   • 顯色后30分鐘內(nèi)完成測定，避免顏色衰減。
   • 離心后上清液需澄清，否則重復離心。
3. 干擾因素：
   • 避免金屬離子污染（如Cu²?干擾顯色）。
   • 底物需完全溶解，防止渾濁影響吸光度。

三、方法學驗證（選做）

• 線性范圍：酪氨酸0-100 μg/mL，R²≥0.99。
• 精密度：重復測定RSD≤5%。
• 回收率：加標回收率90%-110%。

四、應用與意義

結(jié)語