標記基因（NPTII、HLT、PMI）定性PCR檢測方法

一、檢測背景與目的

二、檢測項目與流程

• NPTII（新霉素磷酸轉移酶II）：抗卡那霉素篩選標記。
• HPT（潮霉素磷酸轉移酶）：抗潮霉素篩選標記。
• PMI（磷酸甘露糖異構酶）：甘露糖代謝正向選擇標記。

• DNA提取：使用CTAB法或商業DNA提取試劑盒（如DNeasy Plant Mini Kit）提取樣品基因組DNA。
• DNA純度檢測：通過分光光度計（A260/A280比值1.8–2.0）判定純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。

• 引物序列（示例，需根據實驗調整）：
  • NPTII
    • 正向引物：5′-GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG-3′
    • 反向引物：5′-ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA-3′
    • 產物大小：~200 bp
  • HPT
    • 正向引物：5′-ATC GGC TCC TAT GGC TGT AG-3′
    • 反向引物：5′-CGT CTG TCG AGA AGC CGA AG-3′
    • 產物大小：~350 bp
  • PMI
    • 正向引物：5′-GCA CGG CGA GGA CCT ACA TA-3′
    • 反向引物：5′-TGG CGA TGG TGA TGA TCT TG-3′
    • 產物大小：~500 bp
• 特異性驗證：通過NCBI BLAST比對確認引物特異性，避免與非靶標基因交叉反應。

• 反應體系（25 μL）：
  • 2× PCR Master Mix（含Taq酶、dNTPs、緩沖液）：12.5 μL
  • 正向引物（10 μM）：1 μL
  • 反向引物（10 μM）：1 μL
  • 模板DNA（50–100 ng/μL）：2 μL
  • ddH2O：8.5 μL
• 熱循環程序：
  • 預變性：95°C，5 min
  • 擴增循環（35 cycles）：
    • 變性：95°C，30 sec
    • 退火：根據引物Tm值調整（NPTII：60°C；HPT：58°C；PMI：62°C），30 sec
    • 延伸：72°C，1 min/kb
  • 最終延伸：72°C，5 min

• 陽性對照：已知含有目標基因的質粒或DNA樣本。
• 陰性對照：非轉基因樣本或無模板水。
• 內參基因（如植物actin或tubulin）：驗證DNA質量與擴增有效性。

• 瓊脂糖凝膠電泳：
  • 配制1.5%瓊脂糖凝膠，加入DNA Marker（如100 bp Ladder）。
  • 點樣PCR產物，電泳（電壓：5 V/cm，時間：30 min）。
  • 凝膠成像系統觀察條帶，比對目標條帶大小。
• 判定標準：
  • 陽性：目標位置出現清晰條帶，且大小與預期一致。
  • 陰性：無條帶或條帶大小不符。

三、關鍵注意事項

1. 防污染措施：
   • 分區操作（試劑配制區、模板添加區、擴增區）。
   • 使用帶UDG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）的預混液防止擴增產物污染。
2. 引物優化：若出現非特異性條帶，可通過調整退火溫度或引物濃度優化。
3. 物種特異性：檢測前確認目標物種基因組中無內源性同源基因（如某些植物含PMI類似基因）。

四、應用場景

1. 轉基因作物（如玉米、大豆）的品系鑒定。
2. 食品或飼料中轉基因成分的快速篩查。
3. 環境樣本中轉基因生物的監測。

五、參考文獻

• 引物設計參考NCBI GenBank（如NPTII：登錄號V00618）。
• 《轉基因植物及其產品檢測通用要求》（國家標準GB/T 19495系列）。