一、內標準基因檢測的核心作用

1. 實驗對照：作為陽性對照，驗證DNA提取質量及PCR反應體系有效性。
2. 定量基準：在轉基因定量檢測中，用于計算外源基因與內標基因的拷貝數比值。
3. 物種特異性驗證：確認檢測樣本是否為大豆源性，避免交叉污染導致的假陽性/陰性。

二、大豆常用內標準基因及選擇標準

• 高度保守：僅在大豆中穩定存在，無近緣物種交叉反應。
• 單拷貝：確保定量檢測的準確性（多拷貝基因可能導致計算偏差）。
• 低變異率：在不同品種、生長條件下表達量穩定。

三、核心檢測項目與技術要求

1. 轉基因成分檢測（GMO Testing）

• 檢測靶標：Lectin基因 + 外源基因（如CaMV 35S啟動子、CP4-EPSPS等）。
• 方法：實時熒光定量PCR（qPCR）、數字PCR（dPCR）。
• 標準依據：ISO 21572、GB 19495.4（中國國標）。
• 輸出結果：內標基因Ct值≤30（DNA質量合格）；外源基因定量值（%）。

2. 品種真實性鑒定

• 檢測靶標：SSR/SNP標記 + 內標基因（如Ubiquitin）。
• 方法：毛細管電泳、高通量測序。
• 應用：區分近緣品種，防止品種冒用或混雜。

3. 病原體檢測（病毒/真菌）

• 檢測邏輯：同步檢測病原靶基因（如大豆花葉病毒SMV-CP基因）與大豆內標基因，確保陰性樣本非因DNA降解導致的假陰性。
• 技術：多重PCR、微流控芯片。

4. 基因表達分析（分子育種）

• 內參選擇：Actin、18S rRNA等，需通過geNorm或BestKeeper軟件驗證表達穩定性。
• 應用：抗逆基因（如干旱相關GmDREB）的表達量歸一化。

四、質量控制與標準化挑戰

1. • 需針對不同大豆品種（尤其是野生豆與栽培豆）驗證引物特異性。
   • 例：部分亞洲大豆品種的Lectin基因存在天然突變，需設計替代內標。
2. • qPCR的檢測限需達到≤10拷貝（歐盟轉基因定量檢測要求）。
   • 數字PCR在低含量轉基因樣本（0.1%以下）檢測中更具優勢。
3. • 中國（GB）、歐盟（ISO）、美國（USDA）對內標基因的選擇及閾值存在差異，出口貿易需合規性適配。

五、前沿技術趨勢

1. 多重CRISPR檢測：結合Cas12a/cas13蛋白，實現內標基因與靶基因同步可視化檢測（如試紙條快檢）。
2. 全基因組背景分析：通過WGS數據篩選新型高穩定性內標，提升對野生大豆資源的兼容性。
3. 區塊鏈數據存證：檢測機構將內標Ct值、電泳圖譜等關鍵數據上鏈，增強檢測報告的可追溯性。

六、總結