豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測的重要性

豬瘟（Classical Swine Fever, CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種高度接觸性、致死性傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于該病毒傳播速度快、致死率高，且與非洲豬瘟（ASF）癥狀相似，快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)成為防控疫情的核心手段。實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time RT-PCR）因其高靈敏度、特異性和快速檢測能力，被廣泛應(yīng)用于CSFV的分子診斷。該方法可直接從樣本中檢測病毒RNA，在感染早期或潛伏期即可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)識別，為疫病監(jiān)測、疫情處置及凈化工作提供科學(xué)依據(jù)。

檢測項(xiàng)目與目標(biāo)

豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測的主要目標(biāo)是通過特異性引物和探針，擴(kuò)增并檢測CSFV基因組中的保守區(qū)域（如5'UTR、E2或NS5B基因片段）。檢測樣本包括：感染豬只的血液、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體等組織樣本，或環(huán)境拭子、飼料等潛在污染源。檢測結(jié)果可明確樣本中是否存在CSFV核酸，并可通過Ct值（循環(huán)閾值）半定量評估病毒載量，為臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。

檢測儀器與設(shè)備

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測需依賴以下核心儀器： 1. 熒光定量PCR儀：如ABI 7500、Bio-Rad CFX96或Roche LightCycler，用于擴(kuò)增核酸并實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號。 2. 核酸提取儀：自動化提取設(shè)備（如QIAGEN QIAcube）或手動試劑盒，用于從樣本中純化病毒RNA。 3. 超凈工作臺與離心機(jī)：確保樣本處理過程無污染。 4. 微量分光光度計(jì)或熒光計(jì)：用于檢測RNA純度與濃度。 此外，需配備-80℃超低溫冰箱用于試劑及樣本保存，以及生物安全柜操作高風(fēng)險(xiǎn)樣本。

檢測方法與步驟

檢測流程分為四個(gè)關(guān)鍵階段： 1. 樣本前處理：組織樣本經(jīng)勻漿、離心后取上清液，血液樣本直接裂解處理。 2. RNA提取：使用TRIzol法或商業(yè)化RNA提取試劑盒，遵循“分區(qū)操作”原則避免交叉污染。 3. RT-PCR擴(kuò)增： - 配置反應(yīng)體系：包含逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、特異性引物及TaqMan探針。 - 設(shè)置擴(kuò)增程序：通常為50℃逆轉(zhuǎn)錄15分鐘，95℃預(yù)變性10分鐘，隨后進(jìn)行40-45個(gè)循環(huán)的變性（95℃ 15秒）、退火/延伸（60℃ 1分鐘）。 4. 結(jié)果判讀：根據(jù)熒光信號增長曲線和Ct值判定陰陽性（Ct≤38為陽性，38＜Ct＜40需復(fù)檢，無擴(kuò)增曲線為陰性）。實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陽性對照、陰性對照和內(nèi)部質(zhì)控（如β-actin基因）。

檢測標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制

豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測需遵循以下國際及國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)： - OIE標(biāo)準(zhǔn)：《陸生動物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊》中規(guī)定的CSFV檢測指南。 - 國家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 36871-2018《豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法》。 - 行業(yè)規(guī)范：NY/T 1187-2020《動物疫病分子檢測實(shí)驗(yàn)室技術(shù)規(guī)范》。 實(shí)驗(yàn)室需定期進(jìn)行能力驗(yàn)證（PT），使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)儀器，并通過設(shè)立重復(fù)樣本、空白對照確保檢測結(jié)果的重復(fù)性與準(zhǔn)確性。檢測報(bào)告需明確標(biāo)注檢測限（LOD）、擴(kuò)增效率（90%-110%）及交叉驗(yàn)證數(shù)據(jù)（如與ELISA、病毒分離結(jié)果的一致性）。

通過標(biāo)準(zhǔn)化操作流程與嚴(yán)格質(zhì)控，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對豬瘟病毒的高效監(jiān)測，為疫病防控提供可靠的技術(shù)支撐。