藍(lán)舌病瓊脂免疫擴(kuò)散試驗檢測概述

藍(lán)舌病（Bluetongue，BT）是由藍(lán)舌病毒（BTV）引起的一種經(jīng)媒介昆蟲傳播的動物傳染病，主要感染反芻動物，尤其是綿羊。該病被世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）列為須通報疫病，對畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)影響重大。瓊脂免疫擴(kuò)散試驗（Agar Gel Immunodiffusion Test，AGID）是檢測藍(lán)舌病病毒抗體或抗原的經(jīng)典血清學(xué)方法，具有操作簡便、成本低廉、特異性強等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于基層實驗室和流行病學(xué)調(diào)查。其原理基于抗原與抗體在瓊脂凝膠中自由擴(kuò)散，形成可見的沉淀線，通過觀察沉淀線的位置和形態(tài)判斷結(jié)果。

檢測項目

藍(lán)舌病AGID試驗主要檢測以下內(nèi)容：
1. 抗體檢測：用于篩查動物血清中的BTV群特異性抗體，評估免疫狀態(tài)或既往感染史。
2. 抗原檢測：通過已知抗體檢測疑似樣本中的病毒抗原，輔助診斷急性感染。
3. 分型鑒定：結(jié)合特異性血清，可初步區(qū)分不同血清型的BTV（需與其他方法聯(lián)用）。

檢測儀器與試劑

試驗所需的核心儀器與材料包括：
- 瓊脂糖平皿：厚度1.5-2mm的瓊脂凝膠板（含0.8%-1%瓊脂糖）
- 打孔器：孔徑3-5mm的金屬打孔器，用于制備加樣孔
- 電泳儀或濕盒：維持恒濕環(huán)境（37℃）促進(jìn)擴(kuò)散
- 離心機：處理血清樣本（推薦3000rpm離心10分鐘）
- 標(biāo)準(zhǔn)抗原/抗體：經(jīng)WOAH認(rèn)證的BTV核心抗原及陽性對照血清
- 染色劑（可選）：如考馬斯亮藍(lán)，用于增強沉淀線可見性

檢測方法與步驟

試驗操作流程分為以下步驟：
1. 瓊脂板制備：將瓊脂糖溶于緩沖液（如Tris-HCl，pH 7.2-7.4），加熱溶解后傾注平皿形成凝膠層。
2. 打孔與加樣：以中央孔為抗原孔，周圍6孔為待測血清孔，孔徑間距4-5mm。中央孔加入標(biāo)準(zhǔn)抗原，周圍孔依次加入待測血清和陰陽性對照。
3. 擴(kuò)散反應(yīng)：將瓊脂板置于濕盒中，37℃孵育24-48小時，使抗原抗體充分?jǐn)U散并形成復(fù)合物。
4. 結(jié)果判讀：肉眼觀察是否在抗原孔與待測孔間出現(xiàn)清晰致密的白色沉淀線。陽性樣本沉淀線與對照線完全融合，陰性則無交叉反應(yīng)。

檢測標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制

藍(lán)舌病AGID試驗需嚴(yán)格遵循以下標(biāo)準(zhǔn)：
- 國際標(biāo)準(zhǔn)：參照WOAH《陸生動物診斷試驗與疫苗手冊》第3.1.3章要求
- 國家標(biāo)準(zhǔn)：如中國《GB/T 18636-2017 藍(lán)舌病診斷技術(shù)》中AGID操作規(guī)范
- 試劑驗證：每批次試劑需用已知陰陽性血清驗證靈敏度（≥90%）和特異性（≥95%）
- 實驗條件控制：濕度＞80%，避免瓊脂板干燥導(dǎo)致擴(kuò)散異常
- 交叉驗證：對可疑樣本需結(jié)合ELISA或RT-PCR進(jìn)行復(fù)核

該方法的局限性在于無法區(qū)分疫苗免疫抗體與自然感染抗體，且對早期感染（抗體未產(chǎn)生階段）敏感性較低，需結(jié)合臨床癥狀和分子檢測綜合判斷。