豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時熒光RT-PCR檢測的重要性

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經濟損失。該病毒主要導致母豬繁殖障礙（如流產、死胎）和仔豬呼吸道疾病，且具有高度變異性，易引發(fā)持續(xù)性感染。傳統(tǒng)檢測方法如病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）存在靈敏度低、耗時長等局限性。而實時熒光RT-PCR技術憑借其快速、靈敏、特異性強的優(yōu)勢，已成為PRRSV檢測的核心手段，尤其在疫情早期診斷、疫苗效果評估及病毒分型中發(fā)揮關鍵作用。

檢測項目

實時熒光RT-PCR檢測PRRSV的主要項目包括：

1. PRRSV病原檢測：直接檢測樣本中病毒RNA的存在，適用于臨床疑似病例的快速確診；
2. 病毒分型檢測：區(qū)分歐洲型（Type 1）和美洲型（Type 2）毒株，為流行病學研究和防控策略制定提供依據(jù)；
3. 病毒載量定量分析：通過標準曲線計算樣本中病毒RNA拷貝數(shù)，評估感染嚴重程度和抗病毒治療效果；
4. 疫苗毒株與野毒株鑒別：針對疫苗株特異性基因區(qū)域設計探針，避免疫苗免疫干擾診斷結果。

檢測儀器

PRRSV實時熒光RT-PCR檢測需配備以下核心儀器：
- 實時熒光定量PCR儀（如ABI 7500、Bio-Rad CFX96）：用于擴增反應及熒光信號采集；
- 熒光檢測模塊：支持FAM（針對ORF7基因）、VIC/HEX（內參基因）等多通道檢測；
- 高速離心機與核酸提取儀（如Qiagen QIAcube）：用于樣本RNA的高效提取；
- 超凈工作臺與生物安全柜：確保實驗過程的無污染環(huán)境。

檢測方法

檢測流程分為四步：
1. 樣本處理：采集血清、肺組織或精液，經裂解液處理后提取總RNA；
2. 引物與探針設計：針對PRRSV保守區(qū)（如ORF7、NSP2基因）設計特異性引物及TaqMan探針；
3. RT-PCR擴增：將反轉錄與PCR擴增結合，設置陽性對照（PRRSV標準品）和陰性對照（無模板對照）；
4. 結果分析：根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值）判定病毒存在，Ct≤35為陽性，35＜Ct＜40需復測，無擴增曲線為陰性。

檢測標準

PRRSV實時熒光RT-PCR檢測需遵循以下標準：
- GB/T 22918-2008《豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術》：明確RT-PCR操作規(guī)范及結果判定；
- OIE《陸生動物診斷試驗手冊》：要求檢測靈敏度達到10² copies/μL，特異性無交叉反應；
- 實驗室質控要求：每批次檢測需包含內參基因（如β-actin）以排除RNA降解或抑制物干擾。