一、核酸提取與純化的基礎流程

1. 裂解：通過物理（超聲波、研磨）或化學（裂解液）方法破碎細胞膜/核膜，釋放核酸。
2. 分離：利用離心柱法、磁珠法或有機溶劑（酚-氯仿）去除蛋白質(zhì)、脂類等雜質(zhì)。
3. 純化：乙醇沉淀或柱層析技術去除殘留抑制劑，提高核酸純度。

• 濃度：通過紫外分光光度計（A260/A280比值）或熒光染料（如Qubit）檢測。
• 完整性：瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA/RNA條帶是否完整（如28S/18S rRNA比值）。

二、核酸檢測的重點項目及技術原理

1. 定性檢測

• 原理：通過引物特異性擴增目標DNA片段。
• 應用：病原體檢測（如HPV、HIV）、基因分型。
• 優(yōu)勢：靈敏度高、成本低。
• 局限：僅能判斷目標是否存在，無法定量。

• 原理：在恒定溫度下快速擴增核酸，無需熱循環(huán)儀。
• 應用：現(xiàn)場快速檢測（如新冠病毒、瘧疾）。

2. 定量檢測

• 原理：通過熒光信號實時監(jiān)測擴增過程，結合標準曲線計算初始模板量。
• 應用：病毒載量檢測（如HBV、HIV）、基因表達分析（mRNA定量）。
• 關鍵參數(shù)：Ct值（循環(huán)閾值）、擴增效率。

• 原理：將樣本分割為微反應單元，通過終點熒光信號計數(shù)絕對拷貝數(shù)。
• 優(yōu)勢：無需標準曲線，適合低豐度樣本（如液體活檢中的循環(huán)腫瘤DNA）。

3. 結構分析

• Sanger測序：金標準法，用于短片段精準測序（如突變驗證）。
• 高通量測序（NGS）：全基因組、外顯子組或靶向測序，用于癌癥基因篩查、病原體宏基因組分析。

• 技術：亞硫酸鹽處理結合PCR或測序。
• 應用：表觀遺傳學研究、腫瘤早篩（如結直腸癌SEPT9基因甲基化檢測）。

4. 即時檢測（POCT）

• 技術：CRISPR-Cas系統(tǒng)（如SHERLOCK、DETECTR）結合側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l。
• 優(yōu)勢：無需復雜設備，30分鐘內(nèi)出結果。
• 應用：基層醫(yī)療中的傳染病快速篩查。

三、檢測項目的選擇依據(jù)

1. 靈敏度與特異性：qPCR可檢測低至1拷貝的核酸，而NGS適合未知病原體篩查。
2. 樣本類型：FFPE樣本需優(yōu)先修復DNA片段化問題，液體活檢需高靈敏度技術。
3. 成本與時效：POCT適合現(xiàn)場篩查，NGS則用于科研或復雜診斷。

四、質(zhì)量控制與標準化

• 內(nèi)參基因：qPCR中需加入管家基因（如GAPDH）避免假陰性。
• 陽性/陰性對照：確保檢測體系無污染。
• 標準化流程：遵循CLSI或ISO指南（如ISO 15189）。

五、未來趨勢

1. 一體化檢測平臺：整合提取、擴增和檢測步驟（如微流控芯片）。
2. 單細胞測序：解析細胞異質(zhì)性。
3. 納米孔測序：實現(xiàn)便攜式實時長讀長測序。

結語